|
|
Studium role vybraných izoforem cytochromu P450 v cytostatické rezistenci na úrovni apoptózy
Moriová, Magdalena ; Hofman, Jakub (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Magdalena Moriová Školitel: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Název diplomové práce: Studium role vybraných izoforem cytochromu P450 v cytostatické rezistenci na úrovni apoptózy Cytostatická rezistence je jednou z nejzáludnějších terapeutických překážek v onkologické léčbě. Vedle mechanizmů farmakodynamických hrají v lékové rezistenci důležitou roli též faktory farmakokinetické. Mezi takové mechanizmy zřejmě patří i enzymatická transformace účinné látky na neaktivní metabolit v nádorových buňkách, důkazy o zapojení enzymů ve farmakokinetické rezistenci jsou však dosud veskrze pouze nepřímé nebo zatížené interferenčními elementy. Za využití komparativních experimentů v HepG2 liniích s/bez overexprese CYP3A4 jsme se zaměřili na zhodnocení role tohoto klinicky důležitého enzymu v rezistenci vůči docetaxelu. Metodicky se jednalo o stanovení indukce apoptózy (aktivace kaspáz 3/7, 8 a 9) pomocí komerčních luminiscenčních kitů. Naše výsledky poukazující na signifikantní zapojení enzymu CYP3A4 v omezení účinnosti docetaxelu v intervalu 48 h, přičemž v časnějších intervalech se tento závěr nepotvrdil. Tato zjištění výborně korelují s výsledky našich předchozích studií zaměřených na proliferační úroveň. Získané...
|
|
|
Role mikroRNA v regulaci jaterních enzymů metabolizujících léčiva
Sedlmajer, Štěpán ; Smutný, Tomáš (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Student/ka: Štěpán Sedlmajer Školitel: PharmDr. Tomáš Smutný, Ph.D. Název diplomové práce: Role mikroRNA v regulaci jaterních enzymů metabolizujících léčiva Játra jsou hlavním biotransformačním orgánem v těle. Cytochromy P450 a konjugační enzymy jsou nezastupitelné enzymy v metabolismu léčiv a dalších xenobiotik. V poslední době narůstá poznání o post-transkripční regulaci těchto enzymů pomocí molekul mikroRNA. MikroRNA jako epigenetické regulátory exprese se většinou vážou na zcela nebo částečně komplementární sekvence v 3'UTR (3' untranslated, nepřekládaných) regionech mRNA molekul. MikroRNA mají podíl na interindividuální variabilitě v expresi a aktivitě metabolizujících enzymů. Objasnění jejich role a mechanismů působení může přispět k vývoji nových léčiv a personalizaci farmakoterapie. Práce shrnuje dosavadní vybrané poznatky o regulaci převážně jaterních cytochromů P450 a konjugačních enzymů prostřednictvím mikroRNA. Popsán je také vliv RNA editací, jednonukleotiových polymorfismů a pseudogenů.
|
|
|
Vliv protinádorového léčiva cabozantinibu na aktivitu cytochromů P450
Slobodníková, Eva ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Václavíková, Radka (oponent)
Cabozantinib je protinádorové léčivo používané zejména pro léčbu karcinomu štítné žlázy a ledvinových buněk. Řadí se mezi nízkomolekulární selektivní inhibitory tyrosinkinas. Tyrosinkinasy mají klíčovou roli při přenosu signálů a regulaci řady buněčných procesů, jako je růst, diferenciace a proliferace. Změny v tyrosinkinasových dráhách jsou spojeny se vznikem a progrese nádorů, kde dochází k jejich nekontrolovatelnému růstu. Inhibitory tyrosinkinas působí na tyrosinkinasové receptory, čímž zabraňují dělení nádorových buněk a zároveň zpomalují progresi nádorového onemocnění. Jelikož cabozantinib, stejně jako většina klinicky používaná léčiva, podléhá metabolismu cytochromy P450, může dojít k nežádoucím lékovým interakcím, které mají za následek změnu farmakokinetiky podávaných léčiv, a následné snížení účinnosti těchto léčiv. V této diplomové práci byl sledován účinek cabozantinibu na aktivitu hlavních enzymů I. fáze biotransformace xenobiotik, cytochromů P450, in vitro. Studován byl účinek na aktivitu potkaních i lidských izoforem cytochromů P450, které se účastní metabolismu xenobiotik. Izoformy CYP byly převážně inkubovány s cabozantinibem o dvou koncentracích; 10 µM a koncentraci odpovídající koncentraci substrátu ve specifické markerové reakci. Výsledky prokázaly inhibiční vliv cabozantinibu u...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Vranová, Iveta ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Modelování interakcí cytochromů P450 s flavodoxinem
Culka, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Cytochromy P450 jsou různorodá skupina hemových enzymů vyskytujících se u vět- šiny organismů na Zemi. U lidí zasahují např. do metabolismu cizorodých látek, bakterie jsou schopné díky nim metabolizovat různé hydrofobní substráty. Obecnou reakcí kata- lyzovanou cytochromy P450 je monooxygenace, tedy vnesení jednoho atomu z molekuly kyslíku do substrátu a redukce druhého za vzniku vody. Pro redukci kyslíku je třeba dodávat elektrony, jako donor elektronů u eukaryot obvykle slouží NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa či cytochrom b5, u bakterií však donorem elektronů bývají malé FeS proteiny a flavoproteiny Již dříve bylo ukázáno, že bakteriální donor elektronů fla- vodoxin je schopen dodávat elektrony některým lidským cytochromům P450 in vitro. V této práci jsem se snažil ověřit hypotézu, že flavodoxin je zodpovědný za redukci vybraných lidských (1A2, 2A6, 2A13, 2C9, 2C19, 3A4) a bakteriálních (101A1 a 176A1) cytochromů P450 heterologně exprimovaných v buňkách Escherichia coli. Ke studiu byly použity techniky molekulového modelování. Byla navržena sada možných orientací komplexu jednotlivých cytochromů P450 s flavodoxinem metodou řízeného "dockingu a následně byla ověřena stabilita těchto komplexů řízenou disociací. Byly vybrány nejstabilnější orientace pro každý cytochrom P450, ty byly dále optimalizovány...
|
|
|
Interakce vybraných flavonoidů s cytochromy P450 rodiny 2B
Boštíková, Zdislava ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
V současnosti je kladen větší důraz na zdravý životní styl, který zahrnuje mimo jiné i konzumaci přírodních látek ve formě potravních doplňků. Tyto sloučeniny, často flavonoidního charakteru, vykazují různé chemopreventivní účinky, například antioxidační či proti-karcinogenní účinky. Jejich nadměrná konzumace však může mít i negativní dopad na lidské zdraví. Flavonoidy mohou například ovlivňovat koncentraci biotransformačních enzymů cytochromů P450 v buňkách a tím zasahovat do metabolismu cizorodých látek. Takový zásah by pro člověka mohl mít za následek rozvoj karcinogeneze či neúčinnost některých léčiv. Tato bakalářská práce se zabývá studiem schopností dvou flavonoidních sloučenin myricetinu a dihydromyricetinu indukovat a inhibovat cytochromy P450 rodiny 2B. Pomocí metody Western blotu bylo zjištěno, že ani jeden ze zkoumaných flavonoidů nezvyšuje expresi CYP2B1/2 v játrech, myricetin ani v žádné části tenkého střeva. V případě dihydromyricetinu byla pozorována indukce daných cytochromů P450 rodiny 2B ve střední části tenkého střeva. Inhibiční schopnost flavonoidů byla měřena in vitro jako pokles aktivity CYP2B při O-depentylaci 7-pentoxyresorufinu. Byly zjištěny hodnoty IC50 8,8μM pro myricetin a 0,5mM v případě dihydromyricetinu. Klíčová slova: xenobiotika, cytochromy P450, indukce, metabolismus
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Mechanismus karcinogenity a nefrotoxicity aristolochových kyselin
Bárta, František
Aristolochové kyseliny (AA) jsou lidskými karcinogeny, které rovněž vykazují silné nefrotoxické vlastnosti. Směs AA je obsažena v rostlinách čeledi podražcovitých (Aristolochiaceae), které byly a nadále jsou užívány v tradiční medicíně, zejména v Asii. Aristolochové kyseliny se podílí na vzniku dvou typů nefropatií. Jedna z nich dokonce nese označení nefropatie vyvolaná aristolochovou kyselinou (Aristolochic Acid Nephropathy, AAN). Druhým onemocněním je balkánská endemická nefropatie (Balkan Endemic Nepropathy, BEN). Obě onemocnění jsou doprovázena malignacemi v urotheliální tkáni, které jsou vyvolány karcinogenním působením AA. Zvláštním znakem AAN a BEN je skutečnost, že ne všichni pacienti vystavení působení AA byli postiženi nefropatií a vývojem nádorového onemocnění. Jednou z příčin této skutečnosti mohou být rozdíly v aktivitách a expresních hladinách enzymů biotransformujících AAI, hlavní toxickou složku obsaženou v rostlinném extraktu. Detailní poznání enzymů podílejících se na metabolismu AAI může přispět k objasnění interindividuální vnímavosti vůči AAN, BEN a malignacím. Aristolochová kyselina I je v organismu buď oxidačně detoxifikována anebo redukčně aktivována. Redukční bioaktivace AAI vede ke tvorbě kovalentních aduktů AA s DNA, které resultují ve vznik unikátní transversní mutace...
|
host ::
RSS.